TÉCNICAS DE EDICIÓN GENÓMICA

Existen varias técnicas de edición genómica y todas ellas son funcionales y aplicables a la mayoría de enfermedades que padecemos los humanos, dentro de las enfermedades que más muertes causan es la cirrosis hepática y la principal causa de muerte que esta genera se debe a la formación del carcinoma hepatocelular, los científicos han puesto todo su esfuerzo en descifrar las bases moleculares y genéticas de la formación de este cáncer para así contrarrestarlo o dar mejores soluciones terapéuticas.

Así han logrado el descubrimiento de los ARN interferente que provocan el silenciamiento genético, es un proceso biológico en el que moléculas de ARN inhiben la expresión génica al causar la destrucción específica de moléculas de ARN. Dos categorías de moléculas pequeñas de ARN, conocidas como ARN pequeños interferentes -siRNAs y micro-ARNs, que interaccionan con las proteínas llamadas “Argonauta” (AGO), junto a los denominados ARN que interaccionan con PIWI –piRNAs, son cruciales en la RNAi. El silenciamiento genómico que provocan sobre genes celulares cancerigenos como ZHX1 son cruciales para la disminución de la probabilidad de generar hepatocarcinoma celular.

Fuentes: 

1. Terapias Génicas. Disponible en: https://www.uco.es/intergeneracional/index.php/apuntes/finish/44/4136
2. ELSEVIER. Gastroenterología y Hepatología. Biología celular y genética en el cáncer de hígado. Disponible en: http://www.elsevier.es/es-revista-gastroenterologia-hepatologia-14-articulo-biologia-celular-genetica-el-cancer-13107573

TERAPIA CON STEM CELLS EN LA CIRROSIS HEPÁTICA

En la cirrosis hepática se produce fibrogénesis que involucra un estado inflamatorio crónico y a procesos degenerativos producto de la apoptosis y/o necrosis de células parenquimatosas, las MSCs emergen como una alternativa terapéutica para el tratamiento de la cirrosis hepática. Las MSCs tienen la capacidad de migrar y reclutarse con selectividad en tejidos dañados, de promover la reparación de estos tejidos fundamentalmente mediante la secreción de factores tróficos y citoquinas, de diferenciación y de modular el sistema inmunológico.

Las MSCs pueden incorporarse a tejidos dañados, diferenciarse en componentes del tejido conectivo y colaborar en la reparación tisular, MSCs obtenidas de médula ósea, tejido adiposo o cordón umbilical, entre otras fuentes, podrían diferenciarse en células con características similares a hepatocitos mediante protocolos de diferenciación en condiciones in vitro. Estos protocolos consisten en el cultivo de las MSCs durante 7-9 días suplementadas con factor de crecimiento hepatocitario (HGF), factor de crecimiento de fibroblastos 1 y 4 (FGF1y FGF4), oncostatina M, dexametasona, insulina-transferrina-selenito (ITS), nicotinamida y/o dimetilsulfóxido, o mediante el co-cultivo con hepatocitos. Hepatocitos derivados de las MSCs expresan diversos marcadores característicos de hepatocitos inmaduros, como α-fetoproteína, o maduros, como albúmina, α-1- antitripsina, citoqueratina 18, citocromo P450, factor nuclear 4 alfa de hepatocito1, 26. Estas células se comportan fisiológicamente como hepatocitos, siendo capaces de almacenar glucógeno, metabolizar urea, producir albúmina e incorporar lipoproteínas de baja densidad.
Fuente:
1. Fiore E. Células madre mesenquimales y medicina regenerativa en la cirrosis hepática. Actualizado: 10 de enero del 2017, Último acceso: 15 de Junio del 2018. Disponible en: http://medicinabuenosaires.com/revistas/vol77-17/n2/135-142-Med77-1-6567-Fiore.pdf

ADN RECOMBINANTE EN CIRROSIS HEPÁTICA

DNA RECOMBIANTE EN LA NATURALEZA

Los ácidos grasos omega-3 son productos del metabolismo secundario, esenciales para el crecimiento. La producción de ácido eicosapentaenoico (EPA, 20: 5ω3) por una nueva especie de bacteria marina Shewanella electrodiphila MAR441T.

Esta cepa produjo un alto porcentaje (hasta 26%) de ácidos grasos totales y altos rendimientos (mg / g de biomasa) de EPA por debajo de la temperatura óptima de crecimiento. A temperaturas de crecimiento más altas, estos valores disminuyeron enormemente. La cantidad de EPA producida se vio afectada por la fuente de carbono, que también influyó en la composición de ácidos grasos. Esta cepa requirió Na + para el crecimiento y la síntesis de EPA y las células cosechadas a finales de fase estacionaria exponencial o temprana tenían un contenido de EPA más alto. Tanto la mayor cantidad (20 mg g-1) como el mayor porcentaje de EPA (18%) ocurrieron con crecimiento en L-prolina y (NH4) 2SO4. La adición de cerulenina mejoró aún más la producción de EPA a 30 mg g-1. La mutagénesis química utilizando NTG permitió el aislamiento de mutantes con niveles mejorados de contenido de EPA (de 9,7 a 15,8 mg g-1) cuando se cultivaron a 15 ° C.

DNA RECOMBINANTE ARTIFICIAL EN LA CIRROSIS

La proteína 1 de dedos de cinc y homeoboxes (ZHX1), se localiza en el núcleo de la célula y parece actuar como un represor transcripcional. ZHX1 interactúa con la subunidad α del factor nuclear α (NF-YA), ADN metiltransferasas (DNMT) 3B y ZHX2, todas las cuales están involucradas en la tumorogénesis.Se creo un plásmido recombinante de expresión eucariota que contiene el gen humano ZHX1 (hZHX1) e investigar las actividades biológicas de ZHX1 en el carcinoma hepatocelular que es una afección directa derivada de la cirrosis hepática. Se usó la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa (RT-PCR) para amplificar los fragmentos N y C-terminales (ZHX1-N y ZHX1-C, respectivamente) del gen hZHX1. Los dos fragmentos de PCR se clonaron en el vector pEASY-T1 y se subclonaron en el plásmido pcDNA3 para generar un plásmido pcDNA3-ZHX1 recombinante.
Después de la identificación por digestión enzimática y secuenciación del ADN , el plásmido recombinante pcDNA3-ZHX1 se transfectó en células SMMC-7721. El nivel de expresión de ZHX1 se detectó mediante RT-PCR y análisis de transferencia Western. Se usaron ensayos de curvas de crecimiento celular para evaluar el efecto de ZHX1 en la proliferación celular. Además, la expresión diferencial de ZHX1 entre el cáncer y el tejido hepático cirrótico adyacente se investigó mediante PCR cuantitativa (qPCR). La digestión enzimática y la secuenciación del ADN confirmaron la construcción exitosa del plásmido recombinante, pcDNA3-ZHX1. qPCR y el análisis de transferencia Western demostraron que ZHX1 se expresó de manera eficiente en células SMMC-7721 y la sobreexpresión de ZHX1 puede inhibir la proliferación de células SMMC-7721. Además, la expresión reducida de ZHX1 está muy extendida entre los tejidos cancerosos de los pacientes con HCC. En conclusión, se construyó con éxito un plásmido de expresión eucariota recombinante , pcDNA3-ZHX1. Además, los resultados actuales indican que una baja expresión de ZHX1 puede ser responsable de la hepatocarcinogénesis derivada de cirrosis hepática.

Fuentes: 
1. PubMed. Construction of a recombinant eukaryotic human ZHX1 gene expression plasmid and the role of ZHX1 in hepatocellular carcinoma.Actualizado: 8 de noviembre del 2013, Último acceso: 10 de junio del 2018. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/24064680
2. PubMed. Enhanced eicosapentaenoic acid production by a new deep-sea marine bacterium Shewanella electrodiphila MAR441T. Actualizado: 27 de noviembre del 2017, Último acceso: 10 de junio del 2018. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/29176835

SOUTHERN BLOT Y SECUENCIACIÓN SANGER PARA CIRROSIS HEPÁTICA

Los telómeros son secuencias de ADN repetitivas en los extremos del cromosoma lineal, que protegen los cromosomas contra la fusión y el daño de extremo a extremo, proporcionando estabilidad cromosómica. Las mutaciones con pérdida de función en los genes de mantenimiento de los telómeros son factores de riesgo genéticos para el desarrollo de cirrosis.

Se examinó si las mutaciones de la telomerasa y el acortamiento de los telómeros se asociaron con el carcinoma hepatocelular (HCC) secundario a la cirrosis. La longitud de los telómeros de leucocitos de sangre periférica se midió mediante Southern blot, para las variantes del gen de la telomerasa (enTERT y TERC ) por secuenciación de Sanger.

Se encontraron variantes constitucionales que producen cambios de aminoácidos en la transcriptasa inversa de la telomerasa en una pequeña proporción de pacientes con hepatocarcinoma celular asociado a la cirrosis.

Fuente:
1. Pubmed. Biología telomérica y mutaciones de telomerasa en pacientes cirróticos con carcinoma hepatocelular. Actualizado: 16 de Agosto del 2017, Último acceso: 3 de diciembre del 2017. Disponible en: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/pmc/articles/PMC5558955/

ARTÍCULO DE PCR PARA CIRROSIS HEPÁTICA

• Tema:
 - Estudio de la expresión del receptor LAIR-1 en macrófagos humanos. Posible  implicación en el desarrollo de cirrosis hepática.

• Objetivos:
  - Identificar que receptor inhibidor en los fagocitos codifica el gen LAIR-1.
  - Estudiar la expresión del gen LAIR-1 mediante qRT-PCR en macrófagos peritoneales obtenidos del líquido ascítico de pacientes con cirrosis hepática, y su comparación con los obtenidos para macrófagos de sangre periférica de donantes sanos, como población de referencia.

• Muestra:

   -Líquido ascítico
   -Sangre periférica

•Tipo de ácido nucleico:
  - ARN viral ---------RT----------ADNc

• Extracción:
  -Kit RNeasy
  -Mini kit

• Gen amplificado:
  - Gen LAIR-1

• Tipo de PCR:

  - PCR en tiempo real

• Pasos de PCR:

  - Desnaturalización: 15 seg – 95º C
  - Hibridación: 60 seg – 60º C
  - Extensión: 60 seg – 60º C
Se repiten 40 ciclos.

• Visualización:

  - EFO

Fuente:
Fernández, M., Tapia, A., Rodríguez, J., Ruíz. A., García, P., Martínez. M. Estudio de la expresión del receptor LAIR-1 en macrófagos humanos. Posible implicación en el desarrollo de cirrosis hepática. (Internet) Actualizado: 2013. (Citado: 25 nov 2017). Disponible en: http://congresos.um.es/iiefb/iiefb2013/paper/viewFile/27511/125